2.3.5不变性试验与编号为S1的白头翁汤供试品溶液

1.2.2药材白头翁为毛茛科白头翁属动物白头翁Pulsatilla chinensis (Bge.) Regel的干燥根;秦皮为木犀科地蜡树属动物地蜡树Fraxinus chinensis Roxb.的干燥枝皮或干皮;黄柏为芸喷鼻科黄檗属动物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮;黄连为毛茛科黄连属动物黄连Copits chinensis Franch.的干燥根茎[2]。经广西西医药大学许琼明传授判定,所采办的饮片均为正品。将单味药各批次饮片随机取样组合,获得15批白头翁汤样品,编号为S1~S15,药材产地消息见表1。

2.2.2质谱前提电喷雾电离源(ESI),正、负离子模式,扫描范畴m / z 100~2000;碰撞能量35 eV;离子源温度为600℃;喷雾电压5500 V。通过一级质谱消息确定切确相对证量,二级质谱获得裂解消息,搜刮数据库和查阅文献猜测化合物的布局式消息。

2.3.5不变性试验取编号为S1的白头翁汤供试品溶液,按“2.3.1”项色谱前提,将样品置于室温下,于0、2、4、8、12、24 h进样,成果显示各共有峰相对保留时间的RSD均小于3%,相对峰面积的RSD均小于5%,表白供试品溶液正在24 h内不变性优良。

白头翁汤是由白头翁、黄连、黄柏、秦皮4味药构成,此中白头翁味苦性寒,能入血分,清热解毒,凉血止痢,为君药;黄连清热解毒,燥湿厚肠,为治痢要药;黄柏善清下焦湿热,2药共帮君药清热解毒,燥湿治痢,为臣药。秦皮苦寒而涩,清热解毒兼能收涩止痢,为佐使药。全方4味药共同有度,其药效的阐扬并非是单一无效成分的感化,而是其所含多元化活性成分派合感化的成果,成立指纹图谱时应分析考虑全方,选择具有代表性且取药效相关性强的成分做为质控目标,使物质基准能精确反映原方质量,以帮于更好地阐扬物质基准的参照物功能,典范丹方的质量[22]。

本尝试别离对分歧提取溶剂、分歧提取体例和分歧提取时间进行了调查,基于成分响应值、出峰数目和杂质干扰环境,选择出最优前提。通过比力白头翁汤冷冻干粉别离用甲醇、70%甲醇、乙腈、纯水溶剂提取,发觉用无机试剂超声提取不如纯水出峰数量多,故确定用纯水做为提取溶剂,再比力超声提取和煎煮法提取2种方式。成果发觉,煎煮法色谱峰的出峰数量、峰形、提取化学成分的全面性以及汤剂煎煮愈加合理,因而分析考虑,确定用煎煮法为最佳提取前提。

2.3.2参照峰的选择正在特征图谱中,小檗碱含量较高,色谱峰较不变,故选择小檗碱的色谱峰(13)做为参照峰,计较各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.5.1白头翁汤潜正在Q-Marker的来历定位白头翁汤的化学成分包罗生物碱类、喷鼻豆素类、皂苷类、柠檬苦素类、甾醇类和木脂素类等[11,14]。此中生物碱类、喷鼻豆素类、皂苷类和柠檬苦素类化合物为白头翁汤中次要的化学成分,具有抗炎、抗菌、免疫调理、抗肿瘤等药理感化[15],可能为汤剂阐扬药效的次要物质根本。故将此4类成分做为白头翁汤的潜正在Q-Marker的来历范畴,具体次要成分有白头翁皂苷B4(anemoside B4)、常春藤皂苷C(hederacoside C)、秦皮甲素(esculin)、秦皮乙素(esculetin)、秦皮素(fraxetin)、黄柏碱(phellodendrine)、巴马汀(palmatine)、黄连碱(coptisine)、小檗碱(berberine)9个活性成分为候选化合物。

2.5.4功能富集阐发取通阐发采用基迪奥生物()数据库对114个感化靶点进行京都基因取基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)生物通富集阐发,共筛选出215条相关通,对P值最小的前20条通进行阐发(图8),包罗癌症通、磷脂酰肌醇3-激酶/卵白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/proteinkinase B,PI3K/Akt)信号通、以及缺氧信号转导-1(hypoxia signaling-1,HIF-1)信号通等,这些通可能取白头翁汤医治疾病的感化相关。

本研究通过UPLC-Q-TOF-MS/MS联用手艺对白头翁汤化学成分进行表征,判定出21个化学成分,成立15批白头翁汤指纹图谱标定了16个色谱峰且通过对照品指认出9个化学成分,包罗白头翁的药效成分白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5,黄连的药效成分黄连碱和小檗碱,黄柏的药效成分黄柏碱和小檗碱,秦皮中的的药效成分秦皮素、秦皮甲素和秦皮乙素。未成功指认7个色谱峰,由白头翁汤和单味药材的色谱叠图可大致揣度,峰6来自秦皮,峰1、4、8、9、12来自黄连,峰4、8、9、10、12来自黄柏,此中峰4、8、9、12为黄连、黄柏的共有成分。通过查阅文献,黄连、黄柏共有的成分研究较多为木兰花碱、药根碱、防己碱和表小檗碱等生物碱类成分[23-24],从文献查阅和白头翁汤化学成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS判定成果来看,出峰挨次顺次为木兰花碱、药根碱和表小檗碱且均出峰早于小檗碱,若需明白峰8、9、12能否为这3种物质,后期仍需采办对照品进行比对或通过制备色谱分手手艺取布局判定手艺对这3个色谱峰进行深切的摸索阐发。

1.2.1试剂水为屈臣氏饮用水,甲醇为阐发级,乙腈为色谱级。对照品白头翁皂苷B4(HPLC质量分数≥98%)、白头翁皂苷B5(HPLC质量分数≥98%)、秦皮甲素(HPLC质量分数≥98%)、秦皮乙素(HPLC质量分数≥98%)、秦皮素(HPLC质量分数≥98%)、黄柏碱(HPLC质量分数≥98%)、盐酸黄连碱(HPLC质量分数≥98%)、盐酸小檗碱(HPLC质量分数≥98%)、盐酸巴马汀(HPLC质量分数≥98%),上述试剂均购于成都普思生物科技股份无限公司。

2.1.2单味药样品溶液制备将白头翁汤处方中的白头翁、黄柏、黄连、秦皮的4种单味饮片按“2.2.1”项的煎煮方式制备溶液,即获得单味药样品供试品溶液。

2.5.5“成分-靶点-通”收集建立将白头翁汤的9个活性成分、114个感化靶点、20条通,正在Cytoscape 3.8.2软件中建立“成分-靶点-通”收集图(图9),图中收集错综复杂,1个成分对应多个靶点,每条通由多个靶点调控,表现了中药复方中多成分、多靶点、多路子配合感化疾病的结果。

2.3.4反复性试验取编号为S1的白头翁汤样品,平行制备6份白头翁汤供试品溶液,按“2.3.1”项色谱前提,测定特征图谱,成果显示各共有峰相对保留时间的RSD均小于3%,相对峰面积的RSD均小于5%,表白方式反复性优良。

综上,本尝试初次全面表征了白头翁汤成分的全体样貌,同时将收集药理学取指纹图谱相连系,使用收集数据库成立“成分-靶点-通”收集拓扑布局,对明白指认出的9种药效成分进行筛拔取靶点预测,筛选获得18个环节感化靶点,通过癌症通、PI3K-Akt通和HIF-1通等信号通阐扬医治疾病的感化。不只对白头翁汤质量节制目标成分的合进行了验证,并且白头翁汤功能联系关系性的物质根本,为白头翁汤阐扬功能及药理感化机制的阐释供给了思。

指纹图谱,并连系收集药理学对其功能联系关系物质进行机制预测阐发,为白头翁汤质量节制供给参考根据。指纹图谱,进行类似度评价,婚配共有峰并进行色谱峰归属。基于质谱判定和指纹图谱筛选白头翁汤的无效成分,通过收集药理学成立了“组分phosphatidylinositol-3-kinase/proteinkinase B法能快速判定白头翁汤的成分,成立的白头翁汤指纹图谱阐发方式简洁可行,连系收集药理学发觉白头翁汤个成分取白头翁汤功能属性亲近相关,为白头翁汤的质量节制供给参考,同时也为白头翁汤药效联系关系物质根本的研究及感化机制的摸索奠基根本。

2.3.6指纹图谱成立及类似度评价按“2.1.1”项下方式,别离制备S1~S15白头翁汤供试品溶液,按“2.3.1”项下色谱前提进样测定,记实色谱图。将数据导入中药色谱指纹图谱类似度评价系统(2012年版)软件,设定S1样品的色谱图为参照图谱,操纵多点校正体例,时间窗宽度为0.1 min,平均数法生成指纹图谱和对照指纹图谱。15批白头翁汤样品的指纹图谱(图2),并进行类似度评价,S1~S15的类似度成果别离为0.980、0.973、0.941、0.952、0.956、0.987、0.983、0.987、0.930、0.935、0.981、0.947、0.983、0.933、0.997,成果显示类似度均>0.90。

本尝试还调查波长、流动相构成、色谱柱、体积流量、柱温等前提,此中波长和流动相的选择是本尝试考虑的沉点。白头翁汤的化学成分较为复杂,含有生物碱类、喷鼻豆素类、皂苷类和柠檬苦素类等化合物,测按时选用紫外检测器全波长对样品进行扫描,发觉皂苷类成分正在203 nm下响应较高,生物碱类成分正在345 nm下响应较高,因而着沉调查了203、210、345 nm波长,分析考虑其出峰数量、响应值、峰形、基线等,为了使指纹图谱消息丰硕,避免影响峰值响应和检测成果不变性,多成分正在最大接收波长下的最佳接收而互不干扰,最终确定扫描波长为210 nm。流动相别离调查了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液,发觉用乙腈做为洗脱溶剂,生物碱类成分均呈现较着后拖尾且峰形较宽,若正在流动相中插手缓冲溶剂,也没有较着润色峰形。因而,考虑改换溶剂,利用甲醇洗脱有较好的色谱峰峰形,分手度优良,出峰数量多,响应值高,且不消添加缓冲溶剂,分析考虑选用甲醇做为流动相。

美国Sciex公司,配有ESI源和Sciex OS数据处置软件;Waters Acquity Arc超高效液相色谱仪,SQP型十万分之一电子阐发天平,赛多利斯科学仪器无限公司。SB-800DTD型超声波清洗机,沃特世科技(上海)无限公司;宁波新芝生物科技股份无限公司;四元泵、从动进样器、柱温箱、2998PDA检测器、Waters工做坐,Sciex X500R Q-TOF液质联用仪?

来 源:丘海芯,甘金月,王宝林,杨世林,许琼明,覃喜军,谭小青,高红伟,刘振杰.仲景名方白头翁汤的指纹图谱及功能联系关系物质预测阐发 [J]. 中草药, 2022, 53(6): 1740-1750 .前往搜狐,查看更多

2.1.1白头翁汤样品溶液制备张仲景《伤寒论》中记录白头翁汤的处方为白头翁15 g、黄柏12 g、黄连6 g、秦皮12 g,本尝试按照原方比例进行煎煮,即白头翁-黄柏-黄连-秦皮5∶4∶2∶4。将4种单味药随机组合成的S1~S15样品按比例称取,插手10倍量的水,煎煮2次,每次煎煮1 h,过滤后归并滤液,滤液备用。取滤液过0.22 µm滤膜,即获得白头翁汤供试品溶液。

2.2.3化合物质谱阐发采用UPLC-Q-TOF-MS/ MS对白头翁汤进行阐发,选择正、负离子模式别离对供试品溶液进行扫描,总离子流图(total ions current,TIC)见图1。通过SCIX OS数据处置系统查找质谱响应较高的成分的切确相对证量,取天然产品高分辩质谱数据库(natural procducts HR-MSMS 2.0)进行比对,获得候选化合物,然后通过二级碎片离子及母离子可能的断裂纪律来确定其布局,最初通过市售对照品保留时间的对比,对部门成分的成果做进一步确证。成果显示,从白头翁汤中判定出21个化学成分,各化学成分的保留时间、质谱消息见表2。通过UPLC-Q-TOF-MS/MS联用手艺对白头翁汤的化学成分进行了初步判定,发觉白头翁汤中所含成分可分为生物碱类、喷鼻豆素类、皂苷类和柠檬苦素类4大类成分,取文献研究成果相分歧[11]。为反映白头翁汤内正在全体化学成分环境,尝试将连系指纹图谱和收集药理学对白头翁汤进一步研究,以期领会其药效物质根本。

2.5.6整合阐发白头翁汤次要的功能是清热解毒、凉血止痢,从治痢疾,是医治腹泻的典范名方。通过对环节靶点的相关消息拾掇发觉,信号转导子和激活子3(signal transducer and activator oftranion 3,STAT3)能够将肽激素信号从细胞概况传送到细胞核,正在细胞内被很多细胞因子敏捷激活,一旦激活过度,会导致一系列的疾病发生。

2.5.2候选化合物靶点预测通过检索数据库TCMSP()和Swiss Target Prediction(),查找候选化合物感化靶点,通过UniProt()数据库规范靶点基因名,靶点归并,去除反复值,获得取9个化合物相关的545个靶点。

2.5.3靶点卵白取卵白彼此感化(protein-protein interaction,PPI)收集阐发将获得的545个靶点上传至STRING 11.0正在线阐发数据库(),选择为“homo sapiens”,设置卵白交互参数评分值大于0.96的卵白互做数据,去掉收集中逛离节点,最终筛选到114个节点,将成果以TSV文本格局导入Cytoscape 3.8.2软件建立PPI收集,如图7所示。操纵Cytoscape 3.8.2软件中的“Network Analyzer”功能对PPI收集进行拓扑属性阐发,计较拔取介数中(betweennesscentrality)、接近中(closeness centrality)和度值(degree)3个主要拓扑参数均大于其平均数的靶点做为环节靶点,经筛选获得18个环节感化靶点(表3)。

2.4.2偏最小二乘法判别阐发(partial least squares discriminantanalysis,PLS-DA)[13]将15个批次的白头翁汤样品16个共有峰峰面积的尺度化处置数据导入SIMCA 14.1软件,获得PLS-DA得分矩阵图、载荷散点图和变量主要性投影(variable importance in project,VIP)值图,如图6所示。成果发觉其环节参数R2X、R2Y、Q2的值别离为0.517、0.891、0.685,均大于0.5,申明该模子具有优良的拟合能力及预测能力。而且正在相信区间(95%)内,15批样品存正在必然差同性。按照分布可将样品S1~S15分为2类,样品S13、S7、S8、S1、S11、S4、S14、S10为A类,样品S9、S3、S5、S12、S6、S15、S2为B类,成果取聚类阐发分歧。PLS-DA载荷散点图(图6-B)上每1个点代表1个变量,距离原点越远,表白对样本的区分能力越强。为进一步筛选出对上述样天职类贡献较大的成分,连系VIP图可更曲不雅地看出各色谱峰的影响程度,VIP值>1.0为成心义变量。成果共找到6个成心义变量,顺次为峰2(秦皮甲素)、峰6、峰10、峰16(白头翁皂苷B5)、峰7、峰15(白头翁皂苷B4),见图6-C。申明这6种成分可能是将15批白头翁汤分为2类的差同性质量标记物(quality markers,Q-Marker)。

白头翁汤(BaitouwengDecoction)源于张仲景的《伤寒论》[1],由白头翁、黄连、黄柏、秦皮4味药构成,具有清热解毒、凉血止痢的功能[2],为治湿热痢疾的首选丹方。近年来,对这一保守丹方的化学成分和药理感化的深切研究证明其具有显著的药理活性[3],现已向临床各科扩展[4],且正在兽医临床也有普遍使用。鉴于中药复方具有多成分-多靶点-多通的特点,超高效液相色谱-三沉四极杆飞翔时间质谱联用(UHPLC-Q-TOF-MS/MS)手艺可实现对中药及中药复方化学成分的快速阐发,同时指纹图谱手艺可以或许愈加全面地反映药材的内正在全体化学成分类型,而且可用于评价中药材质量的实正在性、优秀性和不变性,为中药及中药复方质量节制供给无效手段[5-6]。

2.3.3细密度试验取编号为S1的白头翁汤供试品溶液,按“2.3.1”项色谱前提,持续进样6次,记实谱图,成果显示各共有峰相对保留时间的RSD均小于3%,相对峰面积的RSD均小于5%,表白仪器细密度优良。

有研究指出,通过阻断STAT3靶点的促炎信号传导,能够达到抗结肠炎的结果[16-18];AKT1靶点参取细胞凋亡、生物代谢以及碳水化合物代谢等过程,可调理细胞能量代谢形态[19]。KEGG富集发觉,前20条通次要包罗癌症通、PI3K-Akt信号通、酪氨酸激酶受体(tyrosine kinasereceptor,ErbB)信号通以及HIF-1信号通等。此中,PI3K-Akt信号通[20]是调控细胞周期的典范通之一,一些酪氨酸激酶受体能够通过该路子推进细胞繁衍或细胞凋亡,PI3K-Akt信号通能够减藐视性结肠炎病理毁伤,降低促炎细胞因子表达,缓解疾病所致的便血、腹泻现象[21]。由此可猜测,白头翁汤可能通过感化于这些靶点和灵通到清热解毒、凉血止痢的功能。